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A4) Mesure du pH d'un milieu de culture

Seul un pHmètre de bonne qualité et bien étalonné permet de suivre l'évolution fine du pH d'une culture et de régler éventuellement la marche de la culture tout près du pH maximum autorisé de 11,2.

Le pH varie avec la température. Certains ph-mètres possèdent une correction automatique de température. En cas de correction manuelle de température, on majore le pH mesuré à T°C de 0,00625 x (T - 25) pour obtenir la valeur correcte à la température standard de 25°C.

Certains ph-mètres sont équipés d'une échelle en milliVolts plus robuste que l'échelle en pH. Elle permet de calculer le pH à partir de l'indication en mV par la formule théorique:
pH à T°C = (K1 - mV) x K2 /(273 + T)

où K1 et K2 sont deux constantes dépendant de l'électrode (électrode de verre) qu'on détermine par étalonnage à partir de solutions étalons de pH. Cette formule peut s'écrire, pour T = 25°C:
pH = A - mV/B

où A est le pH pour 0 mV et B est la pente en mV/ unité de pH. Des valeurs usuelles sont par exemple A = 7 et B = 50. La valeur des mV mesurés ne dépend pratiquement pas de la température, ce qui est heureux car cela dispense de faire une correction de température: il suffit d'appliquer la formule à la température de référence.

Pour prolonger la durée de vie d'un pH-mètre, le conserver à l'abri de l'humidité. Pour prolonger la durée de vie d'une électrode, maintenir son extrêmité sensible dans une solution saturée de chlorure de potassium dans l'eau distillée, à température supérieure à 15°C, et la rincer soigneusement avant et après les mesures, à l'eau propre et si possible distillée. Si des moisissures s'installent dans la solution de KCl, mieux vaut la renouveler.

La fragilité, la durée de vie limitée des électrodes, et leur coût élevé, rendent difficile l'utilisation d'un pH-mètre professionnel dans beaucoup de situations. Un pH-mètre bon marché, type "stylo", réétalonné fréquemment, peut rendre service, mais sa durée de vie risque d'être courte. Les papiers pH ne sont pas assez précis.

Les solutions étalons de pH vendues dans le commerce sont coûteuses, mais il est possible de les économiser en utilisant comme solutions étalons approximatifs les produits suivants, à conserver à l'abri de la lumière pour éviter que des algues s'y développent spontanément; les pH indiqués correspondent à 25°C:

- acide chlorhydrique N (36,5 g/l): pH 0,1; N/10: pH 1 ; N/100: pH 2
- jus de citron: pH 2,3
- vinaigre "à 6 degrés" (6% d'acide acétique, densité 1,01): pH 2,8
- solution aqueuse à 5,8 g/l de phosphate monoammonique: pH 4
- jus de tomate: pH 4
- solution aqueuse à 5,8 g/l de phosphate monoammonique + 11 g/l de bicarbonate de sodium: pH 7
- bicarbonate de sodium N/10 (8,4 g/l): pH 8,3

- solution aqueuse à 5,3 g/l de carbonate de sodium + 4,2 g/l de bicarbonate de sodium (ou 1,4 g/l de soude + 5,46 g/l de bicarbonate) à l'équilibre avec l'atmosphère (conserver en contact avec l'atmosphère extérieure, ne pas boucher le récipient, rajouter de l'eau pour compenser l'évaporation): pH 9,8 (varie un peu selon teneur de l'air en CO2 et l'altitude)

- carbonate de sodium N/10 (10,6 g/l): pH 11,6
- soude N/100: pH 12; N/10: pH 13; N (40 g/l): pH 14

A5) Mesure de l'alcalinité (alcalimétrie)

On neutralise progressivement un échantillon du milieu de culture ou de l'eau de cendre à étudier par un acide fort de normalité connue (par exemple 100 ml d'acide chlorhydrique concentré + 900 ml d'eau donne de l'acide "N", c'est-à-dire à une molécule-gramme/litre) jusqu'à pH = 4. Soit V le volume d'échantillon et V' le volume d'acide N utilisé. L'alcalinité est égale à V'/V, moles/litre. N.B.: la chute du pH est très brusque en dessous de 4. Si le titre de l'acide n'est pas exactement N, corriger V' proportionnellement.

Exemple: alcalimétrie sur 200 ml d'eau de cendre partiellement carbonatée.

Sur ce graphique, à pH 4 on lit V' = 96 d'où alcalinité totale 96/200 = 0,48 N (soit 0,48 mole de base/litre). A pH 12 on lit V' = 33 d'où potasse libre 33/200 = 0,165 N.
A pH 8 on lit V' = 62 d'où carbonate de potasse = (62 - 33)/200 = 0,145 mole/l, soit 0,29 N.

L'inflexion à pH 8 correspond à la transition carbonate/bicarbonate (ici il n'y avait pas de bicarbonate dans l'échantillon, celui qu'on dose provient de l'acidification du carbonate). Ce qu'on appelle couramment "alcalinité" ou "basicité" correspond à l'alcalinité totale mesurée à pH 4.

N.B. Si l'on n'a pas de ph-mètre, on peut utiliser un indicateur coloré virant autour de pH = 4, comme le méthylorange (10 gouttes de solution aqueuse à 1 % pour 100 ml d'échantillon à étudier) qui vire de l'orange au rouge, ou le papier au "rouge Congo".Attention: L'acide chlorhydrique "concentré" vendu dans certains pays n'est qu'à 20% d'HCl.

A6) Tests de qualité faciles à réaliser

A6.1) Test sur cultures

A6.1.1) Test de filtrabilité

Pour caractériser la vitesse de filtration, un test standard a été établi. Mesurer 400 ml de culture à tester et la verser en 5 secondes dans un filtre à café garni d'un papier-filtre type Mellita N° 4. Noter le volume filtré en une minute. Un volume supérieur à 300 ml correspond à une filtration très facile.

A6.1.2) Mesure de la turbidité du milieu de culture

Elle se fait à l'ombre sur le filtrat obtenu lors du test de filtration (§ A6.1.1), comme une mesure de concentration au disque de Secchi. Un disque de Secchi noir est préférable si la coloration est faible.

A6.1.3) Mesure de l'aptitude au lavage de la biomasse

Après le test de filtrabilité (§ A6.1.1), verser 400 ml d'eau douce dans le filtre en délayant la biomasse et noter le volume filtré en une minute. Si la biomasse est du type "lavable" (ses cellules n'éclatant pas au contact de l'eau douce) ce volume reste proche de celui du test de filtrabilité. Confirmer par un examen microscopique de la biomasse lavée.

A6.2) Tests sur spiruline

A6.2.1) Test de pH

Il est facile d'obtenir une idée de la qualité du lavage ou de l'essorage de la biomasse, soit en prenant le pH de la biomasse pressée (qui doit être entre 7 et 9), soit en mesurant le pH d'une suspension à 4 % de spiruline sèche dans l'eau, qui doit descendre en dessous de 7 au bout de quelques heures. Lorsqu'une spiruline a été séchée à température assez haute (60 à 65°C) et qu'elle est réhydratée, ses cellules éclatent et le pH baisse, jusqu'à 5 parfois. Le pH obtenu est d'autant plus bas que la spiruline est bien essorée. Ce bas pH serait du à l'acidité interne des cellules et/ou à la fermentation commençante.

A6.2.2) Estimation des pigments

Dans le test de pH du § précédent les pigments sont libérés et il est possible de les voir et de juger de leur concentration. Le bleu est parfois lent à sortir (attendre 24 heures par sécurité, en agitant de temps en temps). Parfois il faut préalablement au test chauffer quelques minutes la poudre à 65 °C pour mieux faire éclater les cellules.

Pour apprécier la concentration en phycocyanine (pigment bleu), il suffit de mettre une goutte de solution décantée sur un papier buvard ou papier filtre bien plat et horizontal: on obtient un chromatogramme très net; la coloration et la surface de la tache bleue est une indication de la concentration en phycocyanine. Faire un test parallèle avec une spiruline de concentration connue en phycocyanine, avec la même concentration (4 % dans l'eau), et faire la comparaison des taches à partir de gouttes de même volume.

Pour apprécier la concentration en caroténoïdes (donc en béta-carotène), mélanger à la spiruline sèche en poudre deux fois son poids d'alcool à 90° ou d'acétone, agiter, couvrir et attendre 15 minutes: les caroténoïdes passent en solution, dont la couleur jaune brun plus ou moins forte est une mesure de la concentration. Utiliser le système de la tache sur papier filtre pour l'apprécier. Attention: la coloration de la tache est labile (oxydation).

Une méthode pour faire sortir les pigments sans séchage est le salage de la spiruline fraiche: au bout de quelques jours les pigments passent dans la phase aqueuse et peuvent être appréciés sur papier filtre. Mais en raison de leur très forte concentration dans la phase aqueuse, la lecture des taches est plus délicate. La congélation-décongélation, de préférence répétée, est une autre méthode pour faire apparaître les pigments sans séchage.

A6.2.3) Test de couleur

La couleur verte de la spiruline de bonne qualité est facile à repérer. On peut avoir en stock des échantillons de référence pour comparaison. La nuance de vert dépend de la souche (la Lonar est moins foncée que la Paracas).

A6.2.4) Dosage colorimétrique simplifié de la phycocyanine

Une méthode plus précise pour mesurer la teneur en pigments est la colorimétrie. Partir de la même solution type "test de pH" qu'en Annexe 6.3. Soit C % la concentration de spiruline sèche mise à tremper dans l'eau autour de 4 %. Laisser décanter et prélever la solution bleue, la centrifuger si l'on dispose d'une centrifugeuse de laboratoire. Prélever la solution centrifugée ou bien décantée: environ 0,5 à 1 ml. Diluer ce prélèvement d'un facteur de 100 environ avec de l'eau. Soit DIL ce facteur de dilution, en volume. Mesurer au colorimètre ou spectrophotomètre (cuve à trajet optique 11 mm) la densité optique (DO) à 615 nanomètre (nm) de longueur d'onde, DO615, et à 652 nm, DO652. Calculer le % en poids de phycocyanine par la formule:

1,873 x (DO615-0,474 DO652) x DIL /C

Une valeur correcte est: > 10 % de la spiruline sèche.

N.B. La DO est égale au logarithme (base 10) du rapport lumière incidente/lumière transmise ou du rapport 100 / (% de transmission) ou 100/ (100 - % d'absorption).

A6.2.5) Dosage colorimétrique simplifié des caroténoïdes

Ajouter 25 % d'acétone ou, à défaut, d'alcool à 90°, à une suspension type "test de pH" ci-dessus, et la maintenir 24 heures au réfrigérateur. Soit C la concentration en spiruline dans cette suspension. Décanter, et si possible centrifuger, et prélever P ml de la solution (environ 0,5 ml). Diluer à l'acétone ou à l'alcool. Soit DIL le facteur de dilution en volume. Mesurer la densité optique à 450 nm. Soit DO450 cette densité. La concentration en caroténoïdes totaux dans la spiruline s'obtient par la formule:

DO450 x DIL / 2,8 / C, mg/g

Une valeur correcte est 2,5 mg/g. Le béta-carotène représente environ la moitié des caroténoïdes totaux.

N.B. La DO est égale au logarithme (base 10) du rapport lumière incidente/lumière transmise ou du rapport 100 / (% de transmission) ou 100/(100 - % d'absorption).

A6.2.6) Dosage de l'humidité dans la spiruline sèche (% d'eau)

Mettre la spiruline à tester (environ 200 g, inutile de peser) dans un récipient genre "Tupperware" (deux litres maximum), étanche et suffisamment transparent pour pouvoir lire l'hygromètre digital placé à l'intérieur. Suivre l'évolution du % d'humidité relative (HR) de l'air dans le récipient jusqu'à l'équilibre (environ 15 à 30 minutes) : si ce % est inférieur à 45, la spiruline est conforme à la norme (< 9 % d'eau). 65 % d'HR correspond à 12 % d'eau ;75 % d'HR à 15 % d'eau et 85 % d'HR à 20 % d'eau. Ces chiffres sont pour un équilibrage à 25°C. Pour que la mesure soit exacte il faut que l'ensemble de mesure soit en équilibre non seulement d'humidité mais de température.

A7) Absorption du gaz carbonique atmosphérique par le milieu de culture

Nous avons mesuré la vitesse d'absorption du CO2 de l'air en suivant la décroissance du pH du milieu de culture sans spiruline, avec agitation faible et intermittente. Connaissant la surface exposée à l'air, la concentration en alcali, le volume par m² et la correspondance entre pH et C = rapport molaire CO2/base (cf Annexe A11), il est facile d'en déduire la vitesse d'absorption du CO2 en fonction du pH. On trouve des valeurs croissantes de 0 pour le pH correspondant à l'équilibre avec l'air (vers pH 9,8), à l'équivalent d'environ 5 g de spiruline/jour/m² vers pH 11. La dispersion des résultats expérimentaux est assez grande; il est possible qu'interviennent des catalyseurs ou inhibiteurs d'absorption : c'est pourquoi nous préférons considérer le coefficient d'absorption (ka) comme un paramètre pouvant être ajusté selon de nouveaux résultats expérimentaux.

La théorie dit que la vitesse d'absorption est proportionnelle au coefficient d'absorption et à la différence des pressions de vapeur de CO2 dans l'air et sur le liquide. La pression de vapeur du CO2 sur une solution de carbonate/bicarbonate de sodium est donnée dans la littérature. Kohl et Riesenfield (1960) donnent dans "Gas Purification", Annexes generales - kohl à la page 117, une formule ayant comme variables la température, la basicité et le rapport c (moles de CO2/mole de base), en mmHg:

pCO2 = 68,5 x b^1,29x (2c - 1)² / [(1 - c) x (333 - 1,8 x t) x (0,0487 - 0,0006 x t)]

où
b = basicité du milieu absorbant, gmoles de base forte/litre
c = rapport molaire CO2/base correspondant au pH du milieu
t = température du milieu,°C
L'absorption du CO2, exprimé en g de spiruline/jour/m² se calcule alors par la formule:
0,772 x ka x [0,00076 x vpm x (1 - alt/10000) - pCO2]

où:
ka = coefficient d'absorption,
gmoles de CO2 absorbés/heure/m²/atmosphère
vpm = teneur de l'air en CO2, ppm volumiques
alt = altitude, mètres
0,772 = (44 x 24)/(1,8 x 760)

La valeur de ka moyenne résultant des mesures d'absorption directes et indirectes (productivités des bassins de spiruline alimentés en carbone uniquement à partir de l'air) se situe autour de 20 mais 18 est utilisé au § suivant et dans les exemples de calcul de simulations en Annexes A27 à A30. Nos mesures directes effectuées en 1991 en bassines donnaient ka = 25. En août 1999 un bassin de 6 m² a été rempli de 1000 litres de milieu de culture à base de soude N/10 et agité comme une culture normale. Son pH est tombé de 12,44 à 10,68 en 16 jours, ce qui correspond à ka = 21 (en prenant 46,8 comme % de carbone dans la spiruline).

Analyse du CO2 dans l'air

La formule ci-dessus donnant pCO2 permet de mesurer la teneur de l'air en CO2 avec un matériel très simple, alors qu'un analyseur à infrarouge coûte 4000 U.S.$. Il suffit de faire barboter un petit débit d'air (mini compresseur d'aquarium) à travers un diffuseur au fond d'une éprouvette contenant une solution de bicarbonate de sodium à 8,4 g/l (basicité 0,1 N), et de mesurer le pH à l'équilibre. Le résultat dépend de la température de la solution. Cette méthode est évidemment inadaptée aux changements brusques de teneur de l'air en CO2, à cause de l'inertie de la solution. Pour diminuer cette inertie on a intérêt a réduire le volume de solution et à diviser finement le gaz barbottant.

Pour des mesures à long terme, conserver l'éprouvette à l'abri de la lumière pour éviter son verdissement et ajouter de l'eau distillée pour maintenir le niveau s'il y a évaporation (si la température de la solution est inférieure à la température de rosée de l'air analysé, la solution se diluera progressivement : dans ce cas il faut rajouter du bicarbonate pour maintenir sa basicité à 0,1 N).

Un petit programme gazcarb.exe permet de calculer très facilement la teneur de l'air en CO2 (en vpm = volumes par millions) en fonction de la température et du pH de la solution à l'équilibre. Le programme fournit un tableau pH/vpm pour chaque température désirée.

A8) Interaction Photosynthèse/ Absorption de CO2

Le graphique présente des exemples de variation de la vitesse d'absorption du CO2 de l'air en fonction de la teneur de l'air en CO2 et du pH du milieu de culture, calculée d'après la formule donnée en Annexe A7 (formuleCO2) et exprimée en équivalent spiruline à raison de 1,8 g/g de spiruline pour les conditions: altitude = 0, température = 30°C, ka = 18 et basicité = 0,1 N. On voit qu'il y a peu à gagner à travailler à pH > 10,3.

Sur le même graphique ont été reportées des exemples de variation de la vitesse de photosynthèse, exprimée dans la même unité que l'absorption du CO2 (en productivité de spiruline), en fonction du pH, pour une luminosité et une agitation données, en l'absence d'autres facteurs limitant. Ces exemples ne sont donnés qu'à titre illustratifs sans valeur précise des paramètres autres que le pH.

Si l'on suit une de ces courbes de vitesse de photosynthèse en partant du pH minimum, on voit que cette vitesse diminue au delà de pH 10. Simultanément la vitesse d'absorption du CO2 croit et il vient un moment où les deux vitesses sont égales (les deux courbes se croisent): à partir de là, le pH ne peut plus continuer à croître; ce point d'équilibre correspond à la vitesse de photosynthèse sous une atmosphère ayant la teneur en CO2 indiquée. Le pH à l'équilibre correspondant est d'autant plus haut que les conditions de photosynthèse (lumière, agitation) sont meilleures et que la teneur en CO2 de l'air est plus basse.

A9) Productivité en fonction de l'ombrage calculée par Modèle de simulation "SPIRULIN"(cf Annexe A27) dans les conditions du § A27.5 (Calculs- exemple1), avec taux de purge 1 % et avec ajout de 18 g CO2/jour/m² :

0 % d'ombre = 14,3 g/jour/m²
50 % d'ombre = 13,3 g/jour/m²
75 % d'ombre = 9.9 g/jour/m²
80 % d'ombre = 8,4 g/jour/m²

On voit la faible influence du taux d'ombrage jusque vers 50 %.

A10) Consommation d'eau en fonction de l'ombrage calculée par Modèle de simulation "SPIRULIN" (cf Annexe A27) dans les conditions du § A27.5 (Calculs - exemple1), avec taux de purge 1 % et avec ajout de 18 g CO2/jour/m² :

0 % d'ombre = 732 litres d'eau/kg de spiruline
65 % d'ombre = 556 litres d'eau/kg de spiruline (minimum)
75 % d'ombre = 623 litres d'eau/kg de spiruline
80 % d'ombre = 698 litres d'eau/kg de spiruline

Il existe un minimum de consommation d'eau vers 65 % d'ombrage.

A11) Correspondance entre pH et rapport molaire C = CO2/base (soude ou potasse)

Cette relation est d'une grande importance pour de nombreux calculs intéressant la culture de spiruline. Elle a été établie expérimentalement. Elle dépend faiblement de la basicité.

Un petit programme de calcul reproduit cette relation : Phexc.exe.

A12) Mélanges de carbonate et bicarbonate (de sodium)

a) Pour obtenir une solution aqueuse ayant les caractéristiques suivantes : rapport molaire CO2/base forte = C et basicité b moles/litre, on peut dissoudre les produits suivants dans un litre d'eau :

Carbonate de sodium = 106 x b (1 - C), grammes

+ Bicarbonate de sodium = 84 x b x (2C - 1), grammes

Un petit progrmme de calcul marie cette relation avec celle de l'Annexe A11 et permet de calculer les mélanges carbonate + bicarbonate et soude + bicarbonate donnant un pH désiré pour un basicité donnée : carbicar.exe.

b) Pour passer d'une solution caractérisée par Ci et b à une solution caractérisée par Cf et b, on peut ajouter à un litre de la première

(Cf - Ci) / (1 - Cf) = E, litre d'eau + 84 x E x b, grammes de bicarbonate de sodium.

Mise en garde : le carbonate acheté peut être un mélange de carbonate et bicarbonate (soit par bicarbonatation naturelle du carbonate stocké dans certaines conditions, soit parce qu'il s'agit de natron ou trona) ; avant d'utiliser du carbonate vérifier sa teneur en bicarbonate en prenant le pH d'une solution à 5 g/l.

A13) Neutralisation de l'eau de cendre par le bicarbonate de soude

L'extrait aqueux de cendres de bonne qualité présente généralement un très haut pH lorsqu'il vient d'être fait, jusqu'à 13. Avant de l'utiliser comme base de milieu de culture il faut attendre longtemps (par exemple 15 jours) pour que son pH baisse suffisamment par absorption de CO2 de l'air.

Un artifice pour rendre de tels extraits utilisables instantanément est d'y dissoudre du CO2 pur ou du bicarbonate de soude. La quantité de bicarbonate ("bicarb") à ajouter pour abaisser le pH à 10,5 peut être calculée par l'une ou l'autre des formules suivantes:

bicarb = 187 x (0,55 - C) x b, g/l

bicarb = 1,83 x S - 234 x C x S / (56 + 26 x C), g/l

formules où:

C = rapport molaire CO2/base, déterminé à partir du pH (cf Annexe A11)

b = normalité alcaline de l'eau de cendre, moles/l

S = salinité alcaline (potasse + carbonate de potasse) de l'eau de cendre, g/l

= b x (56 + 26 x C)

N.B. La salinité alcaline S peut se calculer approximativement à partir de la salinité totale déterminée par la densité (en général la salinité alcaline représente les 2/3 de la salinité totale), mais il est plus précis de la déterminer par alcalimétrie à partir de C et b.

Exemple: Une eau de cendres a une densité de 1,013 et un pH de 12,45 à 25°C, soit une salinité totale de 18 g/l et C = 0,4; l'alcalimétrie donne b = 0,2 soit une salinité alcaline S = 13,3; bicarbonate à ajouter = 5,6 g/l.

Application aux solutions de soude caustique :

L'obtention de milieux de culture à base de soude caustique peut être considérée comme un cas particulier de la neutralisation de l'eau de cendre (laquelle est une solution de potasse caustique). Ce cas peut être utile lorsque le carbonate est plus rare que la soude, pour obtenir des milieux à pH moyen. Exemples de mélanges de soude et de bicarbonate de soude pour b = 0,1 moles/litre:

5,4 g de bicarbonate de sodium + 1,44 g de soude par litre d'eau = pH 10,0
5,0 g de bicarbonate de sodium + 1,6 de soude par litre d'eau = pH 10,2
4,6 g de bicarbonate de sodium + 1,8 de soude par litre d'eau = pH 10,5

N.B. L'utilisation de soude caustique est sujette à restriction (cf Annexe A16.1, N.B.).

A14) Composition de divers produits

(N.B.: ppm = mg/litre ou mg/kg)

Sel de mer brut (non raffiné) Analyse du sel de La Salorge de Guérande:

Phosphore: pratiquement 0; potassium: 1 à 2 g/kg; soufre: 3 à 7 g/kg; magnésium: 4 à 8 g/kg; calcium: 1 à 2 g/kg; cuivre: 2,5 ppm; zinc 0,5 à 2 ppm; manganèse: 4 à 8 ppm; fer 30 à 100 ppm.

Cendre de bois

Teneur en solubles très variable (de 1 à 25 %). Dumon donne la composition suivante de la cendre en g/kg:

Phosphore: 43; soufre: 8; potassium 219; magnésium: 90; calcium 236; manganèse: 50; fer: 14 .

N.B. La solubilité du magnésium et du calcium dépend beaucoup du pH: presque nulle à pH 13, elle est sensible à pH 10 (environ 100 ppm de magnésium dans l'eau de cendre, qui est par ailleurs très riche en soufre: 1500 ppm). Le traitement par un acide permet de solubiliser une grande partie de la cendre.

Eaux

Les eaux de rivière ont en moyenne les teneurs typiques suivantes (en ppm): fer = 0,1; calcium = 40; magnésium = 14; soufre = 6. L'appoint d'eau au bassin apporte alors généralement assez de magnésium et de soufre.

L'eau du puits de la Cté du Pain de Vie à Arequipa, Pérou a les teneurs suivantes (en ppm): calcium = 72; magnésium = 16; soufre = 50; potassium et phosphore = négligeables. Si l'évaporation est de 2,4 mm/jour, l'appoint d'eau apporte le soufre et le magnésium, et bien sûr le calcium, pour 20 g de spiruline/jour/m².

L'eau du puits du Foyer de Charité de Bangui (RCA) ne contient pratiquement ni calcium ni magnésium ni fer. Il en est de même de l'eau de la ville de Linares, Chili.

L'eau du puits de l'Ecole d'Agriculture de Catemu, Chili, contient 96 ppm de calcium, 34 de magnésium et 130 de soufre.

Analyse de l'eau d'un lac à spirulines près de Tuléar (Madagascar) : sel = 35 g/l; bicarbonate + carbonates de sodium (pH 10) = 16 g/l; soufre (des sulfates) = 0,5 g/l; fer = 0,44 ppm; calcium = 6,5 ppm; magnésium = 80 ppm; phosphore = 3,6 ppm; azote = 0,3 ppm (dont 0,2 ammoniacal).

Eau du Gardon de Mialet (très peu dure) : contient 22 ppm de calcium et 2,4 ppm de magnésium

Eau de mer (ppm):
fer: 0,002 à 0,02 ; calcium: 400; magnésium: 1272; phosphore: 0,001 à 0,01; soufre: 900; bicarbonate < 150.

Urine humaine

Elle contient environ: Azote =7 à 12 g/l; phosphore = 0,5 à 0,7 g/l; potassium = 2 à 3 g/l; soufre = 0,8 à 1,2 g/l; sel (chlorure de sodium) = 12 g/l; calcium = 0,13 g/l; magnésium = 0,1 g/l; fer = 0,3 mg/l; sucres = 0,15 g/l. Sa "production" est d'environ un litre par jour par personne.

Nitrate du Chili (Salitre potásico)

Ce produit naturel correspond à 2 NaNO3.KNO3; il contient 15 % d'azote, 18,4% de sodium, 11,6% de potassium, 1% de soufre (sous forme de sulfates), ainsi que: 0,12% de calcium, 0,14% de magnésium et de nombreux oligo-éléments (tous les micronutrients nécessaires pour la spiruline). Il est coloré en rose. A ne pas confondre avec le KNO3 (blanc) pur, extrait du salitre, donc également "naturel".

Sang

Azote: 350 mg/l; phosphore: 30 à 70 mg/l; fer: 9 g/l

A15) Matériel de laboratoire utile (voir aussi Annexes generales - A36)

- thermomètres à alcool (de préférence pas au mercure), ou électroniques,
- disque de Secchi,
- densimètre de 1000 à 1050 g/l,
- pHmètre (le papier-pH n'est pas assez précis),
- microscope (même monoculaire, grossissement 100), ou loupe à fort grossissement (15 à 30),
- balances (permettant de peser 100 g à 0,1 g près si possible, ou pèse-lettre, et 3 kg à 5 g près)
- seringues de 5 ou 10 millilitres, compte-gouttes,
- "miniaquarium" faits de deux lamelles de microscope collées au silicone sur 3 côtés,
- récipients en plastique gradués en volumes,
- verres, flacons, bouteilles, bassines,
- papier-filtre ("à café" type Mellita N°4), avec son entonnoir,
- kits d'analyse d'eau (ammonium, nitrate, sulfate, calcium, magnésium, potassium, fer),
- hygromètre (pas indispensable)
- luxmètre (pas indispensable) .

A16.1) Produits chimiques

(Les % indiqués sont les % en poids sur produit pur sauf indication contraire; pm = poids molaire)

- Acide chlorhydrique HCl, pm = 36,5
- Acide citrique COOH-CH2-C(OH)(COOH)-CH2-COOH, pm = 192
- Acide orthoborique H3BO3, pm = 61,8 (17,14 % de bore)
- Acide phosphorique H3PO4, pm = 98 (31,6 % de phosphore)
- Acide sulfurique H2SO4, pm = 98 (32,7 % de soufre)
- Alum de chrome cristallisé, CrK(SO4)2, 12 H2O, pm = 499,4 (10,3 % de chrome)
- Bicarbonate d'ammonium, pm = 79 (17,7 % d'azote)
- Bicarbonate de sodium, pm = 84
- Bicarbonate de potassium, pm = 100
- Butane C4H10, pm = 58 (82,8% de carbone)
- Carbonate de potassium, pm = 138
- Carbonate de sodium, pm = 106
- Chaux, pm = 74 (54 % de calcium)
- Chlorure de calcium, pm = 111 (36 % de calcium)
- Chlorure de manganèse cristallisé à 4 H2O, pm = 198 (27 % de manganèse)
- Chlorure de potassium, pm = 74,5 (52 % de potassium)
- Chlorure de sodium (sel de cuisine), pm = 58,5
- Chlorure de zinc, pm = 136,3 (46,5 % de zinc) [hygroscopique!]
- EDTA (acide éthylène-diamino-tétracétique), pm = 292
- EDTA, sel disodique cristallisé à 2 H2O, pm = 372 (78 % d'EDTA)
- Gaz carbonique, pm = 44 (27,3 % de carbone)
- Magnésium, pm = 24,5
- Monovanadate d'ammonium NH4VO3, pm = 117 (43,6% de vanadium)
- Molybdate de sodium MoNa2O4,2H2O, pm = 242 (39,7% de molybdène)
- Monovanadate d'ammonium NH4VO3, pm = 117 (43,6 de vanadium)
- Nitrate d'ammonium ou ammonitrate (explosif à sec), pm = 80 (35 % d'azote dont la moitié ammoniacal)
- Nitrate de calcium, pm = 164 (24 % de calcium et 17 % d'azote)
- Nitrate de sodium, pm = 85 (16,5 % d'azote; 72,9 % de NO3; 27 % de sodium)
- Nitrate de potassium, pm = 101 (13,9 % d'azote, soit 61,4% de N03; 38,6% de potassium; qualité technique à 91 % de pureté)
- Oxyde de molybdène, MoO3, pm = 143,9 (66 % de molybdène)
- Oxyde de sélénium, SeO2, pm = 111 (70,4 % de sélénium)
- Phosphore, pm = 31
- Phosphate monoammonique, pm = 115 (27 % de phosphore et 12 % d'azote)
- Phosphate diammonique, pm 132 = (23,4 % de phosphore et 21 % d'azote)
- Phosphate dipotassique, pm = 174 (17,8 % de phosphore et 44,8 % de potassium, pureté 97 %) [hygroscopique!]
- Phosphate mixte d'ammonium et de magnésium, pm = 137 ( 10 % d'azote), très insoluble
- Phosphate monopotassique, pm = 136 (22,7% de phosphore, 28,7% de potassium)
- Phosphate tricalcique, pm = 310 (20 % de phosphore, 39 % de calcium)
- Phosphate trisodique cristallisé à 12 H2O, pm = 380 (8,1 % de phosphore)
- Propane C3H8, pm = 44 (81,8 % de carbone)
- Salitre potassique: 15 % d'azote (soit 66 % de NO3), 18,4 % de sodium, 11,6 % de potassium, 1,2 g de calcium/kg, 1,4 g magnésium/kg, 10 g de soufre (soit 30 g de SO4)/kg
- Sélénite de sodium (Na2SeO3), pm = 173 (45,6% de sélénium) [toxique]
- Soude NaOH, pm = 40 (cf N.B. en bas de page)
- Sucre (= saccharose = sucrose = C12H22O11), pm = 342 (42 % de carbone)
- Sulfate de cobalt à 7 H2O, pm = 281,1 (20,3 % de cobalt)
- Sulfate de cuivre cristallisé à 5 H2O, pm = 249,7 (24,9 % de cuivre)
- Sulfate de magnésium cristallisé à 7 H2O (sel d'Epsom), pm = 246,5 (9,6 % de magnésium et 12,7 % de soufre, pureté 98 %)
- Sulfate de nickel NiSO4, 6H2O, pm = 262,9 (22,3% de nickel)
- Sulfate dipotassique, pm = 174 (44,8 % de potassium et 18,4 % de soufre)
- Sulfate de fer FeSO4, 7 H2O, pm =278 (20 % de fer)
- Sulfate de zinc cristallisé à 7 H2O: pm = 287,4 (22,7 % de zinc)
- Urée, CO(NH2)2, pm = 60 (46 % d'azote, qualité engrais agricole)

N.B. Certaines soudes sont fabriquées à l'aide de mercure et peuvent contenir jusqu'à 0,08 mg de mercure par kg (selon recommandation d'Euro Chlor du 26/11/1997). Il convient d'en tenir compte en cas d'utilisation de soude pour préparer un milieu de culture, de manière à ne pas dépasser la norme en mercure dans la spiruline (cf Annexe A17), mais en général cela ne pose pas de problème. La soude solide "perlée" est facile à utiliser. Attention: la soude est un produit très dangereux pour la peau et les yeux (porter des lunettes de protection).

A16.2) Densités apparentes (approximatives)

En l'absence de balance, il est possible de mesurer les volumes de produits:

Densité apparente, g/ml
Acide phosphorique liquide 85% = 1,69 (à 20°C)
Bicarbonate de sodium léger = 0,53 à 0,73
Bicarbonate de sodium dense = 1,1 à 1,2
Phosphate dipotassique = 0,8
Phosphate monoammonique = 0,8
Salitre potasico = 1,3
Sel NaCl = 1 à 1,2
Spiruline broyée = 0,5 à 0,6
Sulfate de magnésium MgSO4,7H2O = 1
Sulfate dipotasique = 1,2
Sulfate de fer FeSO4,7H2O = 1,15
Urée = 0,84

A17) Normes de la spiruline en France

Par rapport au poids sec, en ppm :

Arsenic <= 3
Plomb <= 5
Etain <= 5
Cadmium <= 0,5
Mercure <= 0,1
Iode <= 5000

Tant pour le produit frais que le sec :

Germes aérobies (30°C) <= 100.000 / gramme
Coliformes fécaux (44,5°C) < 10/ gramme
Anaérobies sulfito-réducteurs (46°C) < 100/ gramme
Clostridium perfringens <= 1/ gramme
Staphylococcus aureus <= 100/ gramme
Salmonella : absence dans 25 g.

N.B. Exemples de limites supérieures de pH pour la croissance de microorganismes des aliments :

Staphylococcus = 9,8
Streptococcus = 9,3
Bacillus = 9,3
B. subtilis = 10
Clostridium botulinum = 8,5
Clostridium perfringens = 8,5
Clostridium sporogenes = 9
Lactobacillus = 8
E. coli = 10
Salmonella = 9
Vibrio parahaemolyticus = 11
Pseudomonas = 8
Candida = 9,8
Saccharomyces = 8,6
Penicillium = 11
Aspergillus = 9,3
Listeria monocytogenes = 9,6

A18) Limites de concentrations dans le milieu de culture

Tous les chiffres expriment des mg/litre (ou ppm). Ceux donnés entre parenthèses sont ceux du milieu de culture de base de Zarrouk dans sa thèse (Annexes generales - Thèsezarrouk, page 4) :

Nitrate* = 440 à 6600 (1800)
Ammonium* = 0,3 à 30
Urée* < 50
Phosphate** = 0,1 à 300 (270)
Potassium > 10 (665) et rapport pondéral K/Na < 5
Magnésium*** = 1 à 30 (19)
Sulfate** > 30 (675)
Fer > 0,4 (2)
Calcium**** > 0,6 (14)
Bore = (0,5)
Manganèse = (0,5)
Zinc < 1 (0,05)
Cuivre < 0,001 ? (0,02)
Molybdène = (0,01)
Chrome = (0,01)
Nickel = (0,01)
Cobalt = (0,01)

Notes:

* a) Les doses minimum ne s'appliquent que s'il n'y a pas d'autre source d'azote. Les maxima pour ammonium et urée ne sont pas indépendants puisque l'urée s'hydrolyse en ammonium : c'est l'ammonium total potentiel qui compte, ou plus précisément l'ammoniac libre. Il y a équilibre entre ammoniaque (NH4OH) et ammoniac (NH3) dans l'eau, l'ammoniaque se dissociant elle-même en ions ammonium (NH4) et hydroxyle (OH) : cet équilibre dépend du pH et de la température. L'odeur d'ammoniac est perceptible dès 20 ppm d'ammonium à pH 10 et 20 °C. Plus le pH est haut plus il y aura d'ammoniac libre. La vitesse d'hydrolyse de l'urée dépend elle-même du pH et de la température.

b) Il y a réduction possible du nitrate en ammoniac selon la réaction globale:

NO3K + 2CH2O (hydrate de carbone) = NH3 + 2CO2 + KOH

Notons en passant que la réduction du nitrate donne une augmentation de la basicité, quel que soit l'agent réducteur. Cette équation signifie qu'un kilo de sucre risque d'être équivalant à 500 g d'urée en tant que production d'ammoniac. C'est donc la somme urée plus sucre qu'il faut considérer pour calculer la limite de toxicité, soit la règle pratique: "dose quotidienne d'urée + (dose quotidienne de sucre) / 2 < 50 - 1,7 x (concentration du milieu de culture en ammonium), où doses et concentration sont exprimées en mg/l (en l'absence de sucre ou de nitrates, inutile de tenir compte du sucre dans cette formule).

** D'après la thèse de J.F.Cornet Annexes generales - Cornet: 0,7 ppm de phosphore et 3 ppm de soufre suffisent. Il est probable que 0,05 ppm de phosphore soit encore suffisant (cas de l'eau de mer).

*** Le phosphate mixte de magnésium et d'ammonium et le phosphate de magnésium, très peu solubles, forment facilement des cristaux dans le milieu de culture si leur produit de solubilité est dépassé. Il y a une relation entre le phosphate, le magnésium et l'ammonium, qu'on peut calculer par phos.exe.

**** A pH élevé (> 10,5) la solubilité du calcium diminue par précipitation de calcaire; les concentrations limites en phosphate et fer diminuent également.

Les limites sont souvent soit inconnues ou mal définies. Par exemple le cuivre à la dose utilisée par Zarrouk devrait être toxique. Il se peut que les limites dépendent des conditions de culture.